2024年09月04日，上海交通大学合肥肿瘤早筛创新技术研究院团队在《Advanced Science》杂志以封面论文发表题名为“Early Diagnosis of Colorectal Cancer Based on Bisulfite-free Site-specific Methylation Identification PCR Strategy: High-Sensitivity, Accuracy, and Primary Medical Accessibility”的研究结果。
该研究建立了一种无需重亚硫酸盐转化、适合基层医疗机构实践可用于肠癌早筛/早诊的高灵敏度、高特异性肠癌相关DNA甲基化检测新方法（ColoC-mSTEM），并首次探究了特定甲基化位点是否可作为结直肠癌的肿瘤标志物。
— 文献解读 —
文献篇名：Early Diagnosis of Colorectal Cancer Based on Bisulfite-free Site-specific Methylation Identification PCR Strategy: High-Sensitivity, Accuracy, and Primary Medical Accessibility.
基于无亚硫酸氢盐位点特异性甲基化识别PCR策略的结直肠癌早期诊断：高灵敏度、准确性和初级医疗可及性。
关键词：ColoC‐m STEM；结直肠癌；早期发现；初级医疗可及性；特定甲基化位点
DOI：10.1002/ADVS.202401137
PART-01背景及目的
结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中，CRC的发病率和死亡率分别居于第三位和第二位。CRC通常由腺瘤性息肉演变而来，并遵循“腺瘤-癌”的发展规律，经历5-10年的时间发展为CRC。因CRC具有明确的癌前病变阶段，在癌前病变阶段进行干预是可以治愈的。同时，早期诊断也可以显著提高CRC患者的5年生存率。因此，CRC是最能够从筛查中获益的恶性肿瘤。
由于我国人口基数大且不同地区基层医疗机构水平差距较大，当前CRC筛查方案以高危因素问卷联合粪便隐血检测为初筛，初筛阳性的高危人群再接受结直肠镜检查。然而，该筛查方案存在假阳性率高、癌前病变及早期CRC漏检率高以及肠镜依从性低等问题。因此，为满足临床大规模人群CRC筛查的需求，亟需发展一种基层可及的高敏感度、高特异性的结直肠癌早筛/早诊新方法以及筛查新策略。
DNA异常甲基化修饰作为肿瘤发生的早期分子事件，已被广泛用作肿瘤早筛早诊的生物标记物。越来越多的研究证实，特定基因的异常甲基化在结直肠癌诊断中具有较高的敏感度。然而，DNA甲基化是一种不改变碱基序列的表观遗传修饰。因此，目前的甲基化检测方法，无论是基于测序、分子杂交还是 PCR平台，都需要通过化学法或酶法将甲基化修饰转化为不同的碱基序列，或通过特定的酶识别来甲基化修饰。目前，市面上DNA甲基化检测产品基本都依赖于重亚硫酸转化技术。遗憾的是，此类方法存在转化操作繁琐、耗时长、自动化难度大，并对实验人员专业技能要求高等问题，难以满足基层医疗机构对大规模人群筛查方法的需求。
研究团队前期开发了创新的STEM-PCR（特定末端介导的甲基化特异性PCR）技术，是一种基于普通PCR技术平台、无需重亚硫酸盐转化的特定甲基化位点检测方法（如图1）。技术具有灵敏度高、操作简便以及试剂成本低等优势，是一种完全适配基层医疗机构的理想DNA甲基化检测技术。（Nature Communication, 14, 1169 (2023)）。本研究则基于创新的STEM-PCR技术开发了一种高敏感度、高特异性、操作便捷、基层可及的CRC早期诊断新方法，为实现大规模人群的基层医疗机构进行CRC筛查提供了新技术。
PART-02研究方法
本研究中探讨了STEM-PCR方法是否可以作为临床可获取的早期诊断新工具，以及特定的甲基化位点是否可以作为结直肠癌的肿瘤标志物。
主要研究内容包括：
1.通过生物信息学分析，挖掘和筛选CRC相关的甲基化位点，并建立ColoC-mSTEM检测系统。
为提高位点筛选的效率，该研究首先通过生物信息分析在TCGA和GEO数据库中挖掘结直肠癌相关基因SFRP2和SDC2中的特定甲基化位点。随后，根据STEM-PCR技术原理建立各待测位点的STEM-PCR检测体系，并对检测试剂的分析性能进行系统评估。
2. 设计回顾性病例对照研究，评估基于粪便DNA的预选甲基化位点通过ColoC-mSTEM检测的临床诊断性能。
该研究入组了480例临床样本进行病例对照研究，系统评估所选甲基化位点的临床诊断性能，并筛选可作为结直肠癌早筛/早诊标志物的甲基化位点。入组样本随机分为两组，其中第一组用于初步验证所选位点的临床相关性，第二组用于进一步验证临床相关位点的诊断性能。最终，建立基于DNA甲基化的肠癌早期诊断模型，并与传统肠癌诊断方法的诊断性能进行比较分析
注：本研究中粪便样本收集和DNA提取产品均由上海慧众同康生物科技有限公司提供。
PART-03研究结果
1、基于生物信息学分析结果及已报道的文献最终筛选了９个甲基化位点，并基于STEM-PCR技术建立了可灵敏检测低至0.1%异常甲基化修饰信号、高特异性的特定甲基化位点检测试剂（ColoC-mSTEM），检测结果灵敏度高于标准BSP技术（0.1% vs 0.5%），更适用于甲基化含量低的样本检测。
2、经过临床病例对照研究，在粪便DNA样本中筛选出5个可以作为结直肠癌诊断标志物的候选甲基化位点。其中，单一SDC2-6位点检测在CRC诊断方面具有良好性能（灵敏度91.2%，特异度95.7%），可以作为有效的CRC诊断标志物。此外，还建立了多甲基化位点联合的结直肠癌甲基化诊断模型，对结直肠癌的诊断敏感度为 94.1%，特异性为 95.0%，为结直肠癌早筛/早诊提供了新方法与新思路。
3、与其他无创筛查方法相比，ColoC-mSTEM对非结直肠癌人群的特异性显著高于FOBT，对早期结直肠癌（尤其是I-II期）和高级别腺癌的敏感度显著高于传统临床检测标志物（CEA、CA19-9）。
PART-04研究
基于STEM-PCR技术的ColoC-mSTEM是一种高灵敏度、高特异性CRC 早期诊断新方法。该种DNA甲基化检测方法有潜力替代或补充FOBT，作为基于人群的结直肠癌筛查的主要工具，以降低正常人群中初次筛查的假阳性率。同时与目前常用的肿瘤蛋白标志物相比，ColoC-mSTEM不仅适用于筛查，而且在早期诊断（辅助诊断）方面更为有效。
综上所述，该研究基于STEM-PCR技术发展了高敏感度、高特异性、操作简单的CRC早期诊断新方法——ColoC-mSTEM。该方法是一种极具临床转化应用潜力、真正基层可及的肠癌早期诊断新方法。
原文链接
https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202401137
